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细菌基因组DNA快速提取
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产品: 浏览次数:1030细菌基因组DNA快速提取 
品牌: 1
型号: 1
规格: 1
单价: 1.00元/1
最小起订量: 1 1
供货总量: 1 1
发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
有效期至: 2022-03-15
最后更新: 2016-10-21 16:44
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细菌基因组DNA快速提取试剂盒-离心柱
DN1101 50 次  /DN1102 100 次  /DN1103 200 次

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细菌基因组DNA快速提取试剂盒-离心柱
DN1101 50 次  /DN1102 100 次  /DN1103 200 次
产品介绍:
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱
产品特点
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30kb -50kb,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。 操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
1. 取0.5-2毫升培养菌液(最多不超过2×109个细胞),10,000rpm,离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。
起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整,但是离心吸附柱最大吸附能力是20μg基因组DNA,如果菌体过量超过最大吸附能力,反而会严重降低产量。
2. 加入200μl缓冲液RB重悬,10,000rpm离心30秒,弃上清。将细胞振荡或者吹打重悬于180μl缓冲液RB(革兰氏阴性菌)或者480μl 50mM Na2EDTA (PH 8.0)(革兰氏阳性菌)。
3. 对于革兰氏阴性菌(可选做此步骤):加入5μl溶菌酶(20mg/ml in 10 mM Tris-HCl,pH 8.0) ,颠倒混匀,37℃温育15分钟。
对于革兰氏阳性菌:加入120μl溶菌酶 (20mg/ml in 10 mM Tris-HCl,pH 8.0)颠倒混匀, 37℃温育30-60分钟。12,000rpm离心2分钟,弃上清后将细胞振荡或者吹打重悬于180μl缓冲液RB中。
对于大部分的革兰氏阳性菌如Bacillus subtilis,Micrococcus luteus,Arthrobacter luteus,Nocardia otitidiscaviarum,Rhodococcus rhodochrous和Brevibacterium albidium,使用溶菌酶就可以有效裂解。但是对于某些种类的Staphylococcus,则应该加入60μl溶菌酶(20mg/ml)和60μl lysostaphin (20mg/ml)确保有效裂解。
4. 加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,充分混匀,再加入200μl 结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。
可选做步骤: 如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μl 结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。
5. 冷却后加入100μl 异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
6. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。
7. 加入500μl抑制物去除液IR,12,000 rpm 离心30秒,弃废液。
8. 加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
9. 加入500μl漂洗液WB,12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
10. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好), 室温放置3-5分钟,12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
12. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
注意事项
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。
3. 需要自备异丙醇。
4. 需自备0.5M EDTA和Lysozyme(溶菌酶)(用于革兰氏阳性菌)、lysostaphin(用于某些难裂解的革兰氏阳性菌)。
5. 结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
6. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5, pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
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