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细菌RNA快速提取试剂盒(双柱型)
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产品: 浏览次数:768细菌RNA快速提取试剂盒(双柱型) 
品牌: 细菌RNA快速提取试剂盒
型号: 细菌RNA快速提取试剂盒
规格: 细菌RNA快速提取试剂盒
单价: 1.00元/1
最小起订量: 1 1
供货总量: 1 1
发货期限: 自买家付款之日起 3 天内发货
有效期至: 2022-03-15
最后更新: 2016-10-21 16:44
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详细信息

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操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)

提示:

ð 操作前在裂解液BYS中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如1 ml 裂解液BYS 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的裂解液BYS 4℃可放置一个月。

A.  样品处理:革兰氏阳性G+细菌RNA的提取

离心收集1-2ml菌液(108-109细胞,细菌总量不能超过上限,以免造成降解)到一个1.5ml离心管, 尽可能去除上清,注意残留的上清不能超过20μl。

根据细胞的种类和数量,充分重悬细胞100μl (5x108-7.5x108细胞) TE中(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,Ph 8.0),TE中已加入溶菌酶或者lysostaphin,浓度为1mg/ml,或者直接用TE重悬后,用干净枪头挑取少许溶菌酶加入

室温(15-25℃)温育5分钟/37℃温育15分钟/ lysostaphin,破解细胞壁。每2分钟涡旋振荡10秒帮助破壁。

注意各种细菌破壁的难易程度不一样,一般革兰氏阴性菌可省略该步骤,但是某些阳性难破壁需要提高溶菌酶浓度或者使用lysostaphin, 玻璃珠机械破壁,蛋白酶K消化或者联合使用等方法, 需要根据用户自己的具体情况调节酶的工作浓度和温育温度、时间和选择正确的方法。

B. 样品处理:革兰氏阴性G细菌可直接加入裂解液即可,无需溶菌酶处理。

1. 按以上方法处理的样品加入550μl裂解液BYS,吹打混匀后,漩涡剧烈振荡20秒,充分裂解。

一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物13,000rpm离心3分钟,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步

2. 吸取500μl上清加入DNA清除柱中,(吸附柱放入收集管中)。

3. 13,000 rpm离心1分钟;收集滤液大约500μl 滤液RNA在收集管中,请勿丢弃!!)。

4. 取下DNA清除柱,直接向2ml收集管中加入250μl (0.5倍体积)的无水乙醇,用移液器吹打混匀如果需要得到更多RNA,可按比例放大

5. 立刻将混合物(每次小于750μl,多可以分两次加入)加入一个RNA吸附柱中,(吸附柱放入收集管中)13,000 rpm离心1分钟,弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去,膜上没有残留,如有必要,可以加大离心力和离心时间。

6. 加入500μl去蛋白液 PB;13,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。

7. RNA吸附柱中加入500μl  漂洗液RW,13,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。

8. 重复步骤6一遍。   

9. 将RNA吸附柱放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10. 取出RNA吸附柱,放入一个1.5ml的RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-100μl RNA洗脱液或DEPC处理水(事先在 65℃水浴中加热可提高产量), 室温放置1分钟,12,000 rpm 离心1分钟。

11. 如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl DEPC处理水重复步骤9,合并两次洗液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的

RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选

择。

 

附录1:(细菌分离DNA方法)

1. 取上述步骤3中取下的DNA清除柱,放置DNA收集管上

2. 向DNA清除柱加入500μl 75%乙醇洗涤;13,000 rpm 离心30秒,弃掉废液,重复2遍

3. 室温晾干3-10min,直至无酒精残留

4. 取出DNA清除柱,放入一个1.5ml离心管中,根据预期DNA产量在吸附膜的中间部位加50-100μl TE(pH >8.0)(事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量), 室温放置1分钟,12,000 rpm 离心1分钟。

5. DNA检测,保存

注:可配合我公司的可见光凝胶切胶仪或者使用我公司专业研发生产的可见光凝胶成像系统检测效果,拍照。避免紫外对人体和样品带来的伤害,条带清晰,操作简便。详情可见www.abigen.cn

 

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